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筋肉疲労および衰弱は、最も一般的な遺伝性および後天性疾患の1つであり、筋ジストロフィー、悪液質および加齢に関連する無駄を含む. 筋肉のバルクおよび筋力を改善するために一般に認められている治療法はないので、これらの状態は、患者および公衆衛生に大きな負担をかける. 結果として、組織全体の増殖および分化を制御する分泌タンパク質の形質転換成長因子スーパーファミリーに属する、筋肉成長、ミオスタチン、または成長/分化因子8（GDF-8）の最近記載された阻害剤にかなりの関心が寄せられている体. ミオスタチン遺伝子は、胚発生および成体動物において骨格筋系統の細胞中でほぼ排他的に発現され、筋肉成長の負の制御因子として機能する. 1逆に、ミオスタチン遺伝子の全身性過剰発現は、広範囲の筋肉喪失を特徴とする無駄な症候群をもたらす. 成体動物において、ミオスタチンは、骨格筋に存在する幹細胞である衛星細胞の活性化を阻害するようである. ヒトにおける疾患の治療に対するミオスタチンの潜在的な関連性は、ジストロフィン遺伝子に変異を有するmdxマウスを含む研究によって示唆されており、したがって、Duchenne'sおよびBeckerの筋ジストロフィーの遺伝モデルとして役立つ. 例えば、ミオスタチンを欠くmdxマウスは、正常なミオスタチンを有するそれらのmdx対応物よりも強く、より筋肉だけでなく、線維化および脂肪リモデリングを減少させ、筋肉の再生の改善を示唆した. さらに、野生型またはmdxマウスのいずれかにミオスタチンに対する中和モノクローナル抗体を注射すると、筋肉量および比力が増加し、ミオスタチンが成体動物の筋肉成長の調節に重要な役割を果たすことが示唆される. ミオスタチン遺伝子の変異がウシの二重筋表現型の原因であることが示されているため、ミオスタチンの機能は種間で保存されているようである. ミオスタチンを欠くマウスおよび牛の表現型および多くの哺乳動物種において予測されたミオスタチンタンパク質の高度な配列保存が、ミオスタチンがヒトの筋肉成長を調節するのを助長する可能性を提起している. 我々は、筋肥大を有する小児におけるミオスタチン突然変異の同定を報告し、それにより、ミオスタチンがヒトの筋肉量を調節するのに重要な役割を果たすという強力な証拠を提供する. 患者および対照乳児の筋肉および6日および7ヶ月の年齢（パネルA）、ウルトラノグラム（パネルB）および形態計測分析（パネルC）の子供の写真および患者の血統（パネルD ）. パネルBでは、大腿部の中央部分を通る超音波横断面（線形変換器、10MHz）が、患者と同じ年齢、性別および体重の対照乳児との差異を明らかにする.

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VLは、外側の線維輪、VIvastus中間体、VM線維腫、RF大腿部、およびF大腿骨を示す. パネルCでは、2つの幼児の筋肉断面図の形態学的分析の筋肉の輪郭および結果のretracingsはまた、顕著な差異を明らかにする. 刺激誘発性ミオクローヌスは出生後数時間に発生し、乳児は新生児病棟に入院して評価された. 低血糖およびテストステロンおよびインスリン様成長因子Iのレベルの上昇は除外された. 筋肉肥大は、乳児が6日齢であったときに超音波検査によって確認された（図1Bおよび図1C）. 出生直後およびその後6ヶ月ごとに行われたドップラー心エコー検査および心電図検査は、一貫して正常であった. この小児は、毎分95ビートの脈拍数、70％の左心室駆出率、56％の中間壁での短縮率、および2の心拍出量を有していた. 5歳、彼は筋肉のバルクと強さを増し続けており、彼は腕を伸ばすと横のサスペンションで2つの3キロのダンベルを保持することができます. 子供（III-5）の24歳の母親は、息子で観察された程度ではないが、筋肉に見えた。彼女は健康上の問題は報告しなかった. この研究は、ベルリン大学メディカルセンターチャリティの制度倫理審査委員会によって承認された. 子どもの母親から、ならびにすべての対照被験者の両親から書面によるインフォームドコンセントが得られた.

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ミオスタチンおよび隣接イントロン配列の3つのエキソン（GenBank NT_022197）はすべて、以下のオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってゲノムDNAから増幅された：エキソン1フォワードプライマー、5'ATTCACTGGTGTGGCAAGTTG3 ';エキソン1リバースプライマー、5 'CAGCAGAACTGTTGATATACACTAATAGG3';エキソン2フォワードプライマー、5 'GTTAATGGGAAATAATTTCAGCAAC3';エキソン2リバースプライマー、5 'AGGTTATTATAATGTTATTTTCAGTTATCAC3';エキソン3フォワードプライマー、5 'CAGGCCTATTGATATTACTGATTGTTC3';エキソン3リバースプライマー、5'GACTGTAGCATACTCTAGGCCTATAGCC3 '. 次いで、サンプルを双方向自動配列決定（BigDye Terminator、Applied Biosystems）に付し、g. IVS1 5μg突然変異は、フォワードプライマー5'CAAAGCTCCTCCACTCCGG3 'を用いたプライマー誘発制限アッセイによって確認した。逆ミスマッチプライマー（ミスマッチ下線）5'CAGCAGAACTGTTCATATACACTAATAGGTCTA3 '. エプスタインバーウイルス（EBV）不死化リンパ芽球細胞からTRIzolで全RNAを抽出し、Superscript III（Invitrogen）で逆転写し、. エキソン1とエキソン2との間の境界を横切るいくつかのプライマーの組み合わせを使用した：5 'CATGCAAAAACTGCAACTCTGTGT3' （P1F）、5'AAATGAGAACAGTGAGCAA3 ' （P2F）、5'CAAAGCTCCTCCACTCCGG3 ' （P3R）、および5'ATCCATAGTTGGGCCTTACTACTTTA3 ' （P4R）. 逆転写された対照として、HPRTをマルチプレックスPCR（プライマー、5'CCTGCTGGATTACATTAAAGCACTG3 'および5'CCTGAAGTATTCATTATAGTCAAGG3'）で同時増幅し、. ヒトミオスタチン遺伝子全体にわたる4kbのDNA断片を5 'サイト1へのメッセンジャーRNA（mRNA）の末端. ポリアデニル化シグナルの4kb下流をpCMV5およびMDAF2ベクターにクローニングし、突然変異を部位特異的突然変異誘発によって導入した. COS-7、チャイニーズハムスター卵巣およびA204横紋筋肉腫細胞を、野生型または突然変異体プラスミドで一時的にトランスフェクトした. トランスフェクション効率制御として分泌されたmycタグ付きタンパク質を含むプラスミドと、フリンプロテアーゼ対の二塩基性アミノ酸切断酵素の発現構築物とを同時トランスフェクションして、前駆体ミオスタチンタンパク質のプロセシングを改善した. 14馴化培地を濃縮し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、膜上に移した. 1対照mycタグ付きタンパク質は、mycに対するモノクローナル抗体を用いて検出された.

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一過性にトランスフェクトされた細胞からのRNAをDNアーゼI（Invitrogen）で処理し、P2FおよびP4Rプライマーを用いた逆転写酵素PCRによって増幅した. 野生型および突然変異体のバンドをアガロースゲルから切り出し、精製し、配列決定した. 野生型および突然変異体バンドの相対存在量は、ABI 3100遺伝子スキャナー（Applied Biosystems）上のFAM標識P4Rプライマーを用いた増幅後の相対蛍光を測定し、. 免疫沈降およびウエスタンブロッティングのために、JA-16結合ビーズ（ミオスタチンのC末端ペプチドに対する）を調製し、ミオスタチンを、60μlのパックビーズを0でインキュベートすることによって免疫沈降させた. 洗浄後、結合したミオスタチンを溶出し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によりさらに分離し、メンブランでブロットし、ポリクローナルウサギ抗体L8825でミオスタチンプロペプチド. 筋肉のエコー原性は正常であり、線維症または脂肪組織の沈着の兆候はなかった（図1Bおよび図1C）. AccIは、野生型配列が存在する場合にのみ、166bpのフラグメントを135bpの1つと31bpの1つの2つのセグメントに切断する. レーン3およびレーン4は、コントロール被験体から切断された（切断された）セグメントおよび切断されていない（切断されていない）. パネルBは、Epstein Barrウイルス不死化リンパ芽球細胞における患者由来のメッセンジャーRNA（mRNA）および2人の対照被験者の多重逆転写酵素PCRの結果を示す. ハウスキーピング遺伝子（HPRT）を、ミオスタチン遺伝子の種々のフラグメントと共に増幅し、全ての反応において等しい強度の産物を得た. ミオスタチン産物は、ナンセンス媒介性のメッセンジャー崩壊を示す患者由来のRNAから増幅することができなかった. パネルCは、COS-7細胞にトランスフェクトされた野生型ミオスタチン構築物（レーン1および2）および突然変異ミオスタチン構築物（レーン3および4）由来のP2FおよびP4Rプライマーを用いて生成された逆転写酵素PCR産物を、レーン1および3）およびレーン2およびレーン4を含まない逆転写酵素. イントロン1のスプライスドナー部位でのIVS1 5gの転写は、スプライシングが突然変異したスプライス部位で108bp下流に起こり、突然変異体でより大きな転写産物を生じ、早期終止コドンを生じる. 我々の患者の表現型は、ミオスタチン遺伝子の機能喪失突然変異を有するマウス1,16-18および牛10-13において報告された筋肉増加および肥満の減少を連想させた. 従って、本発明者らは、患者および母親の遺伝子のすべてのエキソンおよび隣接イントロン領域を配列決定した.

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この突然変異は、制限分析（図2A）によって確認され、同様の民族的背景を有する対照被験体からの200個の対立遺伝子には存在しなかったので、共通の多型. この突然変異の存在は、スプライス供与部位の 5位置がヒトのスプライス部位突然変異の共通の位置であるため、患者のミオスタチン前駆体mRNAのミスプライシングの可能性を高めた. 19イントロン1のスプライスドナー部位の配列と対応するコンセンサス配列（AG // gtrag）との一致度を分析するためにShapiro and Senapathy20のスコアリング法を適用したとき、スコアは79. 0（変異体、GT // gtaaat）、ミスプライシングが起こりそうであることを示す. ミオスタチンmRNAの成熟に対するこの突然変異の影響を調べるために、我々は、培養筋肉および非筋細胞におけるヒトミオスタチンmRNAの発現のためのゲノム野生型および突然変異体構築物を生成し、それらから単離したRNAに対して逆転写酵素PCRを行ったトランスフェクト細胞. エキソン1とエキソン2との間の境界を横切るPCRは、野生型構築物について405bpの単一バンドを生じた. しかし、突然変異体構築物については、野生型構築物のトランスフェクション後に得られるものと大きさが等しい2つのPCR産物およびより高分子量の主要な新規産物を検出した（図2C）. IVS1 5g突然変異）、イントロン1（// gtaagt）内の潜在的なスプライス部位の活性化から生じた（図2D）. これらのPCR反応から得られた主要バンドおよびマイナーバンドの相対強度の定量化により、68. 突然変異体構築物からのミオスタチンmRNAの032％（3つのサンプル）がミスクリプスされた（図2C）. ミスマッチmRNAは、108bpの挿入が単一のリジン残基を付加し、それに続いて早期終止コドンを付加するので、重度に切断されたタンパク質を生じると予測される. パネルAは、一時的にトランスフェクトされたCOS-7細胞からの馴化培地中の変異ゲノムミオスタチン構築物からのミオスタチン産生の欠如を示す. ミオスタチンの成熟C末端ドメインに対する抗体は、野生型構築物（レーン1）から12kDのバンドを認識するが、突然変異構築物（レーン2）では認識しない. 対照として、細胞を、両方の集団において豊富に発現されたmycタグ付きタンパク質で同時トランスフェクションした. パネルBは、ラット（レーン1,2および3）、コントロール被験者（レーン4,5および6）および患者（レーン7）からの血清サンプルの免疫沈降または模擬免疫沈降（IP）およびウェスタンブロッティングの結果を示す。免疫沈降物としてのミオスタチンC末端ドメインに対するJA-16抗体（レーン1,2,4,5,7および8）またはなし（レーン3および6）.

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次いで、ウェスタンブロットを、ミオスタチンプロペプチドに対する抗体でプローブした. ミオスタチンプロペプチドに対応するバンドは、ラット血清中に高レベルで存在し、対照被験体由来の血清中にはより少なく存在し、患者由来の血清中には存在しなかった. RNA分析の結果と一致して、野生型構築物でトランスフェクトされたCOS-7細胞からの条件培地においてのみミオスタチンタンパク質が検出されたが、突然変異体構築物でトランスフェクトされた細胞では実質的に存在しなかった（図3A）. チャイニーズハムスター卵巣細胞およびA204横紋筋肉腫細胞を含む他の細胞株でも同様の結果が得られた（データ示さず）. 本発明者らはまた、このスプライス部位突然変異が患者由来の試料中に及ぼす影響を確認しようと試みた. 筋生検標本が欠如しているので、患者のEBV不死化リンパ芽球細胞からミオスタチンmRNAを検査した. これらの細胞は、血球に通常は存在しない低レベルの不正な転写物を発現する傾向がある. 一様でない転写は正常なプロモーターを介して進行し、特定の組織が利用できない場合にはmRNAレベルの突然変異を検出するために使用することができる. 我々は、患者および対照においてハウスキーピング遺伝子（HPRT）の転写物の類似のレベルを検出することができたので、mRNAの一般的な分解は、このネガティブな結果についてはほとんど説明できないと考えている. 未成熟終止コドンはスプライシング可能なエキソンの上流に位置するため、変異体転写物はナンセンス媒介性メッセンジャー崩壊によって特異的に分解され得る. ミオスタチンは、マウスからの血清サンプル中のウェスタンブロッティングによって容易に検出される. おそらく、ヒトの循環ミオスタチンレベルがより低いため、ヒト血清サンプルにおいて同様のアプローチがはるかに困難であることが判明している. ミオスタチンに対する抗体を使用して、我々は最初に免疫沈降によって血清試料中にミオスタチンを濃縮し、次にそのプロペプチド領域に対する第2の抗体でその存在を検出した. 我々は、より強く結合し、成熟ミオスタチンに対する抗体よりも少量のタンパク質を拾うので、プロペプチド（L8825）に対する抗体を選択した. 我々は、ミオスタチンプロペプチドに対応する、ラット血清中の約36kDのバンドを同定した. それは、年齢および性別が一致した対照被験体からの血清サンプルにおいてより少ない程度で存在したが、患者の血清中には存在しなかった（図3B）.

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プロペプチドと成熟ミオスタチンの血清中のモル比が約1：1,15であることから、プロペプチドの非存在が患者における成熟ミオスタチンの非存在を示すと結論づける. これらの結果は、我々の患者がミオスタチン遺伝子に機能喪失変異を有することを強く示し、したがって、ミオスタチンの不活性化がヒト、マウスおよびウシにおいて同様の効果を有することを示唆する. ミオスタチンは心臓でも発現するので、我々は患者の心機能を詳細に監視しているが、心筋症または伝導障害の兆候はまだ検出していない. 我々の結果は、筋肉疲労状態の患者におけるミオスタチンの不活性化によって筋肉の嵩および強度が治療的に増加する可能性を示唆している. 両親からの資金によって支えられている。自助グループHelft dem Muskelkranken Kind、Hamburg e. Schuelke and H bner）、および国立衛生研究所からの助成金（R01HD35887およびR01CA88866、Dr。. H bnerは、ドイツのボン（Bonn）にあるドイツ教育研究省の資金提供を受けている筋ジストロフィーネットワーク（01GM0302）のメンバーです. StolzとTobinはWyeth Pharmaceuticalsの従業員です. Wyeth Pharmaceuticalsの株式を保有するTobinレポート、Dr. Leeは、MetaMorphixの有償コンサルタントとして資格を有し、Johns Hopkins UniversityからMetaMorphixにライセンスされ、Wyethにサブライセンスされたミオスタチンに関連する複数の特許に指定されており、販売ロイヤルティのシェアを得る権利があります. 私たちは彼らの助けを借りて、Xiaoli Chang、Antje Gerlach、Christine Gerstenfeld、Heidemarie Neitzel、Thomas Voit、Angelika Zwirnerに恵まれています。有用な議論のためにOrest Hurko、Neil Wolfman、Seamus McDuffに、 myc-タグタンパク質を含むプラスミドおよびmycエピトープに対するモノクローナル抗体を提供するためのJeremy Nathans. ）、ボルチモアのジョンズ・ホプキンス大学医学部;心臓血管および代謝疾患部、Wyeth Research、ケンブリッジ、マサチューセッツ州. Schuelke神経科、チャリティ、ベルリン大学医療センター、Augustenburger Platz 1、D-13353 Berlin、ドイツ、またはMarkus. Nature 1997; 387：83-90Crossref Web of Medline2. Dev Biol 2002; 251：241-257Crossref Web of Medline3.

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トランスフォーミング増殖因子 - スーパーファミリーメンバーであるミオスタチンは、心筋において発現され、梗塞後に心筋細胞においてアップレギュレートされる. J Cell Physiol 1999; 180：1-9 Crosslink Web of Medline図1. 患者および対照乳児の筋肉および6日および7ヶ月の年齢（パネルA）、ウルトラノグラム（パネルB）および形態計測分析（パネルC）の子供の写真および患者の血統（パネルD ）. 患者および対照乳児の筋肉および6日および7ヶ月の年齢（パネルA）、ウルトラノグラム（パネルB）および形態計測分析（パネルC）の子供の写真および患者の血統（パネルD ）. パネルBでは、大腿部の中央部分を通る超音波横断面（線形変換器、10MHz）が、患者と同じ年齢、性別および体重の対照乳児との差異を明らかにする. VLは、外側の線維輪、VIvastus中間体、VM線維腫、RF大腿部、およびF大腿骨を示す. パネルCでは、2つの幼児の筋肉断面図の形態学的分析の筋肉の輪郭および結果のretracingsはまた、顕著な差異を明らかにする. AccIは、野生型配列が存在する場合にのみ、166bpのフラグメントを135bpの1つと31bpの1つの2つのセグメントに切断する. レーン3およびレーン4は、コントロール被験体から切断された（切断された）セグメントおよび切断されていない（切断されていない）. パネルBは、Epstein Barrウイルス不死化リンパ芽球細胞における患者由来のメッセンジャーRNA（mRNA）および2人の対照被験者の多重逆転写酵素PCRの結果を示す. ハウスキーピング遺伝子（HPRT）を、ミオスタチン遺伝子の種々のフラグメントと共に増幅し、全ての反応において等しい強度の産物を得た. ミオスタチン産物は、ナンセンス媒介性のメッセンジャー崩壊を示す患者由来のRNAから増幅することができなかった. パネルCは、COS-7細胞にトランスフェクトされた野生型ミオスタチン構築物（レーン1および2）および突然変異ミオスタチン構築物（レーン3および4）由来のP2FおよびP4Rプライマーを用いて生成された逆転写酵素PCR産物を、レーン1および3）およびレーン2およびレーン4を含まない逆転写酵素.

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